style="width:3.08672in" />GB/T 18935—2018 本文是学习GB-T 18935-2018 口蹄疫诊断技术. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了口蹄疫(Foot and mouth
disease,FMD)临床诊断和实验室诊断的技术要求。
本标准适用于猪、牛、羊等偶蹄动物及其他易感动物口蹄疫的诊断。
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件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
下列缩略语适用于本文件。
CPE: 致细胞病变(Cytopathic effect)
DNA: 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)
ELISA: 酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay)
FMD: 口蹄疫(Foot and mouth disease)
FMDV: 口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus)
HRP: 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)
IDs:半数感染剂量(Median infective dose)
LPB: 液相阻断(Liquid phase block)
MEM: 最低必需培养基(Minimum essential medium)
NSP: 非结构蛋白(Non structural protein)
O-P 液：食道-咽喉部分泌物(Oesophageal-pharyngeal fluids)
OPD: 邻苯二胺(O-Phenylenediamine)
PBS: 磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline buffer)
RNA: 核糖核酸(Ribonucleic acid)
RT-PCR: 反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain
reaction)
SPC: 固相竞争(Solid phase competition)
TCIDso:半数细胞感染量(Median tissue culture infective dose)
TMB: 四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine)
VN: 病毒中和试验(Virus neutralisation test)
偶蹄目动物，包括牛科动物(牛、瘤牛、水牛、牦牛)、绵羊、山羊及所有野生反刍动物和猪科动物对口
蹄疫病毒均易感，驼科动物易感性较低。马属动物不感染口蹄疫。
GB/T 18935—2018
4.2.1 易感动物卧地不起或跛行，牛可见呆立流涎。
4.2.2 易感动物唇部、舌面、齿龈、鼻镜、蹄踵、蹄叉、乳房等部位出现水泡。
4.2.3
发病后期，水泡破溃、结痂，严重者蹄壳脱落，恢复期可见瘢痕、新生蹄甲。
4.2.4
传播速度快，发病率高；成年动物死亡率低，幼畜常突然死亡且死亡率高，仔猪常成窝死亡。
4.3.1 消化道可见水泡、溃疡。
4.3.2 幼畜可见骨骼肌、心肌表面出现灰白色条纹，形色酷似虎斑。
易感动物出现上述临床症状和病理变化，可判定为疑似口蹄疫。
确诊应采集有临床症状动物的水泡皮、水泡液，也可采集未见明显临床症状易感动物的血清、反刍
动物 O-P 液进行实验室诊断。
5.1.5 离心管(2 mL,10 mL)。
5.1.6 10 mL～20 mL注射器。
5.1.10 高速组织匀浆机。
5.2.1 0.1 mol/L PBS(pH7.4),配方见附录 A 的 A.1。
5.2.2 0.04 mol/L PBS(pH 7.4),配方见 A.2。
5.2.3 50%甘油 -PBS 保存液，配方见A.3。
5.2.4 O-P 液保存液，配方见 A.4。
5.2.5 0 . 2%柠檬酸或2%氢氧化钠。
5.2.6 青霉素1000 IU/mL。
5.2.7 链霉素500 IU/mL。
典型临床发病动物水泡液用灭菌注射器吸出后装入样品保存管，加青霉素1000
IU/mL、 链霉素
GB/T 18935—2018
500 IU/mL,加盖封口，冷冻保存。
用0.04 mol/L PBS(pH7.4)清洗水泡表面，然后用灭菌手术剪刀剪取水泡皮，2
g～5g 为宜。采集
到的水泡皮，装入样品保存管，加50%甘油-PBS
保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，冷冻保存。
若采集不到典型的水泡皮，则采集病灶周围破溃组织2 g～5g,
装入样品保存管，加50%甘油-PBS
保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，冷冻保存。临床表现健康，但需做口蹄疫病原学检测的动
物，可在屠宰时采集淋巴结、脊髓、扁桃体、心脏肌肉。对肉品进行口蹄疫病原学检测时，可采集骨骼肌。
组织样品应不少于2 g,装入样品保存管中，密封、冷冻保存。
5.3.4 反刍动物 O-P 液样品采集
被检动物在采样前禁食(可饮水)12 h。
食道探杯在使用前经0.2%柠檬酸或2%氢氧化钠浸泡
5 min
消毒，再用洁净水充分冲洗。每采完一头(只)动物，探杯都要进行消毒并充分清洗。采样时动物
站立保定，将探杯随吞咽动作送入被检动物食道上部10 cm～15cm
处，轻轻来回移动2～3次，然后将 探杯拉出。如采集的O-P
液被胃内容物严重污染，用水冲洗被检动物口腔后重新采样。在10mL 离心
管中加3 mL～5mLO-P 液保存液，将采集到的 O-P
液倒入离心管中，密封后充分摇匀，冷冻保存。
采集动物血液，每头应不少于5 mL。 无菌分离血清，装入2 mL
离心管中，加盖密封后冷藏或冷冻
保存。
样品处理的生物安全措施按照GB19489 进行。
将采集的动物机体组织，置组织匀浆器中充分研磨，加入青霉素1000 IU/mL、
链霉素500 IU/mL, 0.04 mol/L
PBS(pH7.4)制成1:5的组织悬液，4℃浸毒过夜。次日以3000 r/min 离心10
min,取上
清液备用。
水泡液以3000 r/min 离心10 min,取上清液备用。
将 O-P
液倒入灭菌塑料离心管内，再加入不少于样品1/3体积量的三氯三氟乙烷或氯仿。用高速
组织匀浆机以10000 r/min 搅拌3 min, 然后以3000 r/min 离心10 min。
此时液体分成两相，将上层
水相分装入样品保存管中备用。
GB/T 18935—2018
6.1.2 冰箱(2℃~8℃、 -20℃、 -70℃不同温度)。
6.1.5 微量移液器(5 μL 、10μL 、100μL 、200μL 、1000μL 等不同规格)。
6.1.6 1 mL 注射器。
6.1.7 25 cm² 细胞培养瓶。
6.2.1 0.04 mol/L PBS(pH 7.4),配方见 A.2。
6.2.2 细胞培养液与细胞维持液，配方见 A.5。
6.3.1 3日龄吮乳小白鼠(乳鼠)。
6.3.2 犊牛甲状腺细胞原代细胞。
6.3.3 仔猪肾细胞系(IB-RS-2)。
6.3.4 幼仓鼠肾细胞系(BHK-21)。
6.4.1.1
接种乳鼠：5.4中浸毒过夜后的组织悬液或水泡液上清液，或 O-P
液上层水相接种3日龄乳 鼠，每只乳鼠颈背部皮下接种0.2 mL。
同时设健康对照，对照乳鼠颈背部皮下接种0.2 mL 0.04 mol/L PBS(pH 7.4)。
6.4.1.2 观察记录：接种12 h
以后，对乳鼠进行连续观察。健康对照乳鼠整个病毒分离期间应无异常
表现。若被检样品中有口蹄疫病毒，通常在接种2 d～3d
后，实验乳鼠出现口蹄疫感染症状，表现为后
腿运动障碍，麻痹，头部不能抬起，呼吸紧张，以致死亡。发病或发病死亡乳鼠在解剖时常见膀胱积尿
现象。
6.4.1.3 盲传：若接种乳鼠第一代72 h
后未见发病症状，则处死第一代乳鼠，按5.4.2所述方法将乳鼠
胴体制成1:5组织悬液，按6.4. 1. 1所述方法在乳鼠上接种。如此盲传3代。
6.4.1.4 收集发病死亡乳鼠胴体，保存于50%甘油-PBS
保存液中，置-70℃保存，用于病毒鉴定。
6.4.2.1
制备单层细胞：按常规法将原代细胞(犊牛甲状腺细胞)或继代细胞(IB-RS-2
、BHK-21) 分装在 25cm² 细胞培养瓶中，每瓶分装细胞悬液5 mL,
细胞浓度应为2×10⁵个/ mL～3×10⁵ 个/mL,37℃ 培 养48 h。
6.4.2.2
接种细胞：5.4中浸毒过夜后的组织悬液或水泡液上清液，或 O-P
液上层水相接种细胞。牛源 样品接种犊牛甲状腺细胞或 BHK-21
细胞，猪源样品接种 IB-RS-2 或 BHK-21 细胞，其他来源样品接种 BHK-21
细胞。每份样品接种2～4瓶细胞，另设细胞对照2～4瓶。接种前，先倒去细胞培养瓶中的营
养液，加入1 mL 已经处理好的病料液，室温静置30 min。 然后再加4 mL
细胞维持液。细胞对照瓶不 接种样品，倒去营养液后加5 mL
细胞维持液，37℃培养。
6.4.2.3
观察和记录：若被检样品中有口蹄疫病毒，通常在接种1 d～2d 后可出现CPE,
主要呈现细胞
圆缩、聚集，最后溶解脱落。对照细胞单层应完好，细胞形态基本正常或稍有衰老。收获细胞液，置
-70℃保存，用于病毒鉴定。
6.4.2.4 盲传：如接种细胞第1代72 h 后未出现 CPE,
收获细胞/病毒液按6.4.2.2所述方法再接种生长 48h 的单层细胞进行盲传，即1
mL 第1代细胞/病毒液加4 mL 细胞维持液，37℃培养。如此盲传3代。
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对发病死亡乳鼠和出现CPE 的细胞培养液，选用第7章(定型 ELISA)、 第9章(定型
RT-PCR) 进 行血清型鉴定，也可选用第8章(多重RT-PCR)、 第10章(病毒 VP1
基因序列分析)、第11章(荧光定
量 RT-PCR) 进行核酸鉴定和分析。
6.6.1
乳鼠盲传3代无发病症状、细胞盲传3代未见细胞病变，且经6.5所述方法检测阴性者，判定病
毒分离阴性。
6.6.2 对发病死亡乳鼠和出现CPE
的细胞培养液，经6.5所述方法任一项检测阳性者，判为病毒分离 阳性。
7 定型酶联免疫吸附试验(定型 ELISA)
7.1.2 与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器。
7.1.5 96 孔平底聚苯乙烯酶标板。
7.1.7 微量可调移液器(5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格)。
7.1.10 封板膜
7.1.11 吸水纸巾。
7.2.1 捕获抗体：各型兔抗 FMDV146S 抗原抗血清，由提纯的各型 FMDV146S
完整病毒粒子免疫兔
子制备而成，用pH 9.6 的包被缓冲液将捕获抗体稀释至工作浓度。
7.2.2 检测抗体：各型豚鼠抗 FMDV146S
抗原抗血清，用与制备捕获抗体同源的各型 FMDV 146S 完
整病毒粒子免疫豚鼠制备而成；或者是辣根过氧化物酶(HRP) 标 记 的 各 型 抗
FMDV 型 特 异 性 单 克 隆 抗体，用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度。
7.2.3 对照抗原：FMDV 灭 活 抗 原 。FMDV 于 单 层 BHK-21
细胞上繁殖，病毒培养液经二乙烯亚胺灭
活后离心除去细胞碎片，上清液作为对照抗原，使用时用样品稀释液稀释至工作浓度。
7.2.4 包被缓冲液：碳酸盐缓冲液，0.05 mol/LNa₂CO₃-NaHCO₃ ,pH9.6,
配方见附录 B 的 B.1。
7.2.5 样品稀释液：含0.05%(体积分数)吐温-20的0.01 mol/LPBS,pH 7.2～7.4,配
方 见 B.2。
7.2.6 酶标抗体稀释液：按5%(质量浓度)比例在样品稀释液中加入脱脂奶粉。
7.2.7 洗涤缓冲液：含0.01%(体积分数)吐温-20的0.002 mol/L PBS,配 方 见
B.3。
7.2.8 底 物 溶 液 ：OPD 底物溶液，配方见 B.4.1;TMD 底物溶液，配方见
B.4.2。
7.2.9 终止液：1.25 mol/L 硫酸，配方见 B.5.1;2 mol/L硫酸，配方见 B.5.2。
7.2.10 兔 抗 豚 鼠IgG
HRP标记物：用健康兔血清阻断，用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度。
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7.3.1 包被酶标板：将工作浓度的捕获抗体分别包被 ELISA
板第1列至第12列(也可根据待检样品数 量调整包被孔数),按 O、A、Asia1
型的顺序包被酶标板，每个血清型包被1列，每孔加50μL, 用封板膜
封板，置于4℃过夜(或38℃±0.5℃,100 r/min～200 r/min振荡孵育2 h)。
7.3.2 洗涤：每孔中加满洗涤缓冲液，放置30 s
后弃去，重复洗涤6次后在吸水纸巾上拍干酶标板。
7.3.3 加对照抗原和待检病原样品：ELISA 板 第 1 列 A、B 两孔加O
型抗原，第2列 A、B 两孔加 A 型 抗原，第3列 A、B 两孔加 Asial
型抗原，以此类推，其余孔加被检样品，每份样品每个血清型加2孔，每 孔加50
μL。 每型设2孔阴性对照，阴性对照孔每孔加50μL
样品稀释液。用封板膜封板，置于38 ℃士 0.5℃旋转振荡器中振荡60 min。
同7.3.2洗涤。
7.3.4 加豚鼠抗血清和兔抗豚鼠IgG HRP 标记物或加各型抗 FMDV
型特异性单克隆抗体工作液：将 工作浓度的豚鼠抗 FMDV
各型抗血清逐个加入与包被兔抗 FMDV 血清同型的各孔，即包被兔抗 O 型 FMDV
抗血清的孔则加豚鼠抗 O 型 FMDV 抗血清，包被兔抗 A 型 FMDV
抗血清的孔则加豚鼠抗 A 型 FMDV
抗血清，以此类推，每孔加50μL,封板后同前振荡孵育60 min,
同7.3.2洗涤后加兔抗豚鼠 IgG HRP标记物，每孔加50μL,
封板后同前振荡孵育45 min, 同7.3.2洗涤。或者将工作浓度 HRP 标
记的各型抗FMDV
型特异性单克隆抗体加入到包被同型兔抗血清的各孔和阴性对照孔，每孔加50μL,
封板后同前振荡孵育60 min, 同7.3.2洗涤。
7.3.5 加底物溶液、终止液，判读结果
加豚鼠抗 FMDV 各型抗血清和兔抗豚鼠IgG
HRP标记物时，洗涤板子后加入预热至38℃±0.5℃ 的 OPD 底物溶液，每孔加50μL,
封板，避光38℃±0.5℃振荡孵育15 min。 每孔加50μL1.25 mol/L
终止液，混匀后在酶标仪492 nm 下判读结果。
加 HRP 标记的各型抗FMDV
型特异性单克隆抗体时，洗涤板子后加入预热至38℃±0.5℃的 TMD
底物溶液，每孔加50μL, 封板，避光38℃±0.5℃振荡孵育15 min。 每孔加50μL2
mol/L硫 酸
终止液，混匀后在酶标仪450 nm 下判读结果。
7.4.1 结果计算：相对 OD 值=被检样品各血清型平均 OD 值一
同型阴性对照(N) 平均 OD 值 。
7.4.2 某型阴性对照(N) 平均 OD 值大于0.20,试验不成立。
7.4.3 阳性对照 OD
值应大于或等于0.6,阴性对照应小于或等于0.20,试验成立。
在试验成立的前提下：如果样品各型的相对 OD
值小于或等于0.20,则该样品为阴性；如果样品某 型的相对 OD
值大于或等于0.3,则判定该样品此血清型阳性；如果样品某型的相对 OD
值大于0 . 2但
小于0.3,则判为可疑，需要重新测定，再次测定结果，若某型的相对 OD
值小于0.30,则该样品为阴性，
如果样品某型的相对 OD 值大于或等于0.3,则判定该样品该型口蹄疫抗原阳性。
8 多重反转录-聚合酶链式反应(多重 RT-PCR)
8.1.3 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。
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8.1.4 凝胶成像仪(或紫外透射仪)。
8.1.5 微量可调移液器(5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL 等不同规格)。
8.1.6 无核酸酶水处理的离心管与吸头。
下列3条引物为上游引物：
a) 5'GAC TCG ACG TCT CCC GCC AAC T 3'。
b) 5'ACG ACG GGG GCT TTT GCT TTC AC3'。
c) 5'CGG GAA ACG CAC GAG CAG TAT C 3'。
下列3条引物为下游引物：
a) 5'TGC GGA CGG CCA CCT ACT ACT TC 3'。
b) 5'AGC TCC ACG AAA AAG TGT CGAG 3'。
c) 5'CGT GAT GTG GCG AGA ATG AAG AA 3'。
8.3.1.1 变性液：6 mol/L 异硫氰酸胍或 Trizol
reagent。
8.3.1.2 2 mol/L 乙酸钠(pH4.0
8.3.1.3
酚氯仿抽提液：苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)混合液。
8.3.1.4 异丙醇(分析纯
8.3.1.5
无核酸酶水：可将焦碳酸二乙酯按0.1%(质量浓度)的量加入双蒸馏水(ddH₂O)
中制备。
8.3.1.6
75%乙醇：无水乙醇(分析纯)与无核酸酶水按3:1配制而成。
8.3.2.1 10 × 一步 RNA PCR 缓冲液。
8.3.2.2 反转录酶(AMV
8.3.2.3 核糖核酸酶抑制剂(RNase inhibitorU/μL。
8.3.2.4 AMV-Optimized Taq 酶：5 U/μL。
8.3.2.5 dNTP 预混液：包括 dATP 、dTTP 、dCTP
、dGTP, 各10 mmol /L。
8.3.2.6 MgCl₂:25 mmol/L。
8.3.3.1 电泳缓冲液：50×TAE 贮存液(配方见附录 C 的
C.1), 临用时加蒸馏水配成1×TAE 缓冲液 (配方见 C.2)。
8.3.3.2 琼脂糖：国产或进口的低熔点琼脂糖。
8.3.3.3 电泳加样缓冲液：配方见C.3。
8.3.3.4 DNA Marker(标准分子量bp～1000 bp,100 bp 梯度。
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8.4.1 本方法适用所有的FMD 病原样品种类，包括水泡皮、水泡液、O-P
液、扁桃体、淋巴结、骨髓、肌 肉、病毒接种乳鼠与细胞培养物等。
8.4.2 阳性对照：已知病毒材料，如FMDV
感染的乳鼠或细胞，与待检样品同时提取总RNA, 再反转录 和 PCR
扩增，其扩增产物作为电泳对照样品。
8.4.3 阴性对照：未感染的乳鼠或细胞，与待检样品同时提取总RNA,
再反转录和 PCR 扩增。
8.5.1.1 酚氯仿法抽提核酸
8.5.1.1.1 取待检样品、阴性对照、阳性对照各300 μL 分别置于1.5 mL
离心管中，每管加入300μL 变 性液，反复混匀，冰水浴5 min。
8.5.1.1.2 每管分别加入60μL2 mol/L 乙酸钠(pH 4.0),混匀。
8.5.1.1.3 每管加800μL 苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)混合液，冰水浴5
min。
8.5.1.1.4 8000 r/min 离心10 min 。 将上清液转入另一洁净离心管。
8.5.1.1.5 加800μL 异丙醇，混匀，室温放置15 min。
8.5.1.1.6 4℃,12000 r/min,离心10 min,
小心的倒掉上清液。尽量倒干液体，留下 RNA 沉淀。
8.5.1.1.7 加1000μL75% 乙醇颠倒洗涤沉淀，4℃,10000 r/min, 离 心 5 min,
小心倒干液体，室温干 燥5 min～10 min。
8.5.1.1.8 每管加10 μL 无核酸酶水，用于溶解 RNA 。 总 RNA
提取液可立即用于 PCR 扩增，也可
-70 ℃冰箱保存备用。
8.5.1.2 核酸提取等效方法
可采用等效 RNA
提取试剂和方法，如采用自动化核酸提取仪和配套核酸抽提试剂进行核酸提取。
8.5.2.1 PCR 反应混合液配制：10× 一步 RNA PCR
缓冲液50μL,MgCl₂100μL,dNTPs 50μL,上下 游引物对各30μL, 无核酸酶水110μL,
在超净工作台中混匀，分装入 PCR 扩增管中， - 20℃保存 备用。
8.5.2.2 多 重 RT-PCR 扩增：在已分装有 PCR
反应混合液的 PCR 扩增管中分别加入已制备好的总 RNA 提取液5μL,
盖紧管盖，放入扩增仪中按照设定程序扩增：50℃反转录30 min,94℃ 预变性
2 min; 然 后 9 4 ℃ 变 性 5 0s,58℃ 退火50s,72℃ 延伸60
s,共进行35次循环；最后72℃延伸8 min。
8.5.3.1 1.5%琼脂糖凝胶板的制备：称取1.5 g
琼脂糖，加入100 mL1×TAE 缓冲液中。加热融化后 加 5 μL(10mg/mL)
溴乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5 mm 左右。依据样品
数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔),放入电泳槽中，加1×TAE
缓 冲 液淹没胶面。
8.5.3.2 加样：取6μL～8μLPCR 扩增产物和2 μL
加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同 时设标准 DNA
Marker、阴性对照、阳性对照。
8.5.3.3 电泳：电压80 V～100V 或电流40 mA～50
mA,电泳30 min～40 min。
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电泳结束后，取出凝胶板置凝胶成像仪(或紫外透射仪)上观察。阳性对照电泳结果应为三个条带，
分别为634 bp、483 bp和278 bp,阴性对照应无扩增条带。
符合8.6的条件，被检样品至少扩增出一条DNA
条带，且与阳性对照条带分子量大小相符，则该样
品判定为FMDV 核酸阳性。被检样品无扩增条带，判为 FMDV 核酸阴性。
9 定型反转录-聚合酶链式反应(定型 RT-PCR)
同8.1。
下列为下游引物和分别检测FMDV7 个血清型的上游引物：
a) 下游引物(通用):5'-AGCTTGTACCAGGGTTTGGC-3'。
b) 上游引物(O 型):5'-GCTGCCYACYTCYTTCAA-3'。
c) 上游引物(A 型):5'-GTCATTGACCTYATGCAVACYCAC-3'。
d) 上游引物(C 型):5'-GTTTCTGCACTTGACAACACA-3'。
e) 上游引物(Asia1 型):5'-GACACCACHCARRACCGCCG-3'。
f) 上游引物(SAT1 型):5'-AGGATTGCHAGYGAGACVCACAT-3'。
g) 上游引物(SAT 2型):5'-GGCGTYGARAAACARYTBTG-3'
h) 上游引物(SAT3 型):5'- TTCGGDAGAYTGTTGTGTG-3'。
其中，Y、R、H、V、D为简并碱基，Y 对应C/T,R 对应A/G,H 对应A/T/C,V
对应G/A/C,D 对应
A/T/G。
同8.3。
同8.4。
同8.5.1。
9.5.2.1 RT-PCR 反应体系配制，采用25 μL
反应体系，扩增体系配制如下： 10× 一步 RNA PCR缓冲液 2.5μL
MgCl₂(25 mmol/L) 5μL
dNTP (各10 mmol/L) 2.5 μL
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RNase 酶抑制剂(40 U/μL) 0.5 μL
AMV(5 U/μL) 0.5μL
AMV-Optimized Taq(5 U/μL) 0.5μL
下游通用引物(50 pmol/μL) 0.5 μL
上游型特异性引物混合(各50 pmol/μL) 0.5μL
总 RNA 水溶液 12.5μL
9.5.2.2 扩增程序。将PCR
扩增管盖紧管盖，放入扩增仪中按照设定程序扩增：50℃反转录30 min,
94℃预变性4 min;然后94℃变性50 s,58℃~60℃ 退火40 s,72℃ 延伸40
s,共进行30次循环；最
后72℃延伸8 min。
同8.5.3。
电泳结束后，取出凝胶板置于凝胶成像仪(或紫外透射仪)上观察。阳性对照扩增产物电泳结果应
分别为 O 型400 bp,A 型730 bp,C 型600 bp,Asia 1 型300 bp,SAT1 型430
bp,SAT 2 型260 bp,
SAT3 型380 bp,阴性对照应无扩增条带。
符合9.6的条件。样品扩增产物的 DNA
条带与某型阳性对照条带分子量大小一致，则该待检样品
为某型 FMDV。 如被检样品无扩增条带，则该样品为 FMDV 核酸阴性。
同8.1。
FMDVO 型、A 型、Asia 1 型通用 VP1
扩增引物：VP1F:5'-GCGCTGGCAAAGACTTTGA-3';
VP1R:5'-GACATGTCCTCCTGCATCTGGTTGA-3'。
同8.3。
同8.4。
10.5.1 核酸提取
同8.5.1。
10.5.2 RT-PCR 反应
10.5.2.1 RT-PCR 反应体系配制，采用50 μL
反应体系，扩增体系配制如下：
GB/T 18935—2018
10×一步 RN A PCR 缓冲液 5μL
dNTP(10 mmol/L) 5μL
MgCl₂(25 mmol/L) 10μL
RNase 酶抑制剂(40 U/μL) 1μL
反转录酶(AMV)(5 U/μL) 1μL
Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 1μL
正向引物 VP1F(25 pmol/μL) 1μL
反向引物 VP1R(25 pmol/μL) 1μL
总 RNA 提取液 10μL
无核酸酶水 15μL
10.5.2.2 扩增程序：将 PCR
扩增管盖紧管盖，放入扩增仪中按照设定程序扩增：42℃反转录30 min,
9 5 ℃ 变 性 2 min; 然后95℃变性60 s,55℃ 退火60 s,72℃ 延 伸 8 min,
共进行30～35次循环。
10.5.3 扩增产物电泳检测
同8.5.3。
电泳结束后，取出凝胶板置于凝胶成像仪(或紫外透射仪)上观察。阳性对照扩增产物目标条带大
小应为810 bp,阴性对照应无扩增条带。
样品扩增产物的DNA 条带与阳性对照条带分子量大小一致，则表明扩增出该样品
FMDV VP1 基
因。扩增 DNA 片段测序：RT-PCR 产物纯化后，可直接用于 DNA
序列测定，测序引物与 RT-PCR 扩增
引物相同。应用DNA 序列分析软件(如 DNAStar、MEGA
等)进行序列分析。参考序列见 FAO/OIE
世界口蹄疫参考实验室网站 http://www.wrlfmd.org/fmd
genotyping/prototypes.htm。 通过序列同
源性分析，即可确定病毒的基因型，进行遗传关系分析。
11 荧光定量反转录聚合酶链式反应(荧光定量 RT-PCR)
11.1.1 荧光定量 PCR 仪。
11.1.2 其余器材同8.1。
下列两个引物和探针组合中，任一个都可以用于FMDV 的荧光定量 PCR:
a) 5'UTR 正向引物：CACYTYAAGRTGACAYTGRTACTGGTAC; 反向引物：CAGATYCCRA
GT- GWCICITGTTA;TaqMan 探针：CCTCGGGGTACCTGAAGGGCATCC。
b) 3D 正向引物： ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA; 反向引物 GCGAGTCCTGCCACGGA;
TaqMan 探针：TCCTTTGCACGCCGT GGGAC。
其中，Y、R、W 为简并碱基，Y 对应 C/T,R 对应 A/G,W 对应 A/T;I
为修饰碱基。
同8.3。
GB/T 18935—2018
同8.4。
11.5.1 核酸提取
同8.5.1。
11.5.2 荧光定量 RT-PCR 反应
11.5.2.1 在离心机中旋转平板或PCR 管 1 min,
混匀每管内容物，反应总体系25μL。 2 × 一 步 RT-PCR 缓冲液 12.5 μL
TaKaRa Ex Taq HS(5 U/μL) 0.5μL
PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5μL
PCR 正向引物(10 μmol/L) 0.5μL
PCR 反向引物(10 μmol/L) 0.5 μL
探针(5 μmol/L) 1μL
总 RNA 2μL
无核酸酶水 7.5 μL
11.5.2.2 把平板或PCR 管放在荧光定量 PCR
仪器上进行RT-PCR 扩增，按照下面的程序扩增：42℃
反转录15 min;然后95℃变性10 s,55℃ 退火30 s,72℃ 延伸30
s,共进行40次循环。
11.6.1 阳性对照扩增曲线应呈标准的 S 曲线，且Ct 值应小于25。
11.6.2 阴性对照扩增曲线应为基线下的水平线。
若样品曲线呈标准的S 形曲线，且Ct 值小于35为阳性；Ct
值大于或等于35为阴性。
12.1.1 恒温CO₂ 培养箱。
12.1.2 倒置生物显微镜。
12.1.3 96孔细胞培养板。
12.1.4 微量可调移液器及配套吸头。
12.2.1 阳性对照血清：FMDV
感染动物或口蹄疫疫苗免疫动物血清，56℃水浴灭活30 min。
12.2.2 阴性对照血清：未接触过 FMDV 的动物血清，56℃水浴灭活30 min。
12.2.3 待检血清：待检血清经56℃水浴灭活30 min。
12.2.4 病毒：FMDV 分别适应于 BHK-21 或 IB-RS-2
单层细胞。收获的病毒液测定 TCIDs 后，分装 于小管， -70℃保存备用。
GB/T 18935—2018
12.2.5 细胞：BHK-21 或 IB-RS-2 传代细胞。
12.2.6 细胞维持液：Eagle's MEM
与含5%水解乳蛋白的Earle's液等量混合配成，pH 7.6～7.8,在
中和试验中作稀释液用。
12.2.7 细胞营养液：含10%犊牛血清的细胞维持液(pH7.4), 培养细胞用。
12.2.8 细胞染色液：用10%福尔马林配制的0.05%亚甲基蓝溶液。
12.3.1 FMDVTCID 预测定：将 FMDV
在96孔培养板上作10倍连续稀释，即10-1,10-²,10-3, … , 10- Ⅱ,每孔50 μL
病毒液，100 μL 细胞悬液(细胞悬液的浓度以在24 h 内长满单层为度，
一般每毫升
100万个～150万个细胞),每个稀释度8孔。每块板的最后一列设8孔细胞对照，每孔补加50
μL 稀释 液(不加病毒)。置37℃5% CO₂ 温箱培养。观察 CPE,72 h
时将板固定并作常规染色(先用10%福 尔马林固定30 min,
然后置于用10%福尔马林配制的0.05%亚甲基兰溶液中浸泡染色30 min, 最后将
培养板用水冲洗)。未病变细胞呈蓝色，病变细胞脱落或不着色。依据CPE
情况，按 Reed-Muench 法 计算病毒 TCIDso。
12.3.2
稀释血清：用细胞维持液将待检血清在培养板上从1:4开始作2倍连续稀释，每份血清至少平
行稀释2排孔，每孔50μL。
12.3.3 加入病毒：在上述每孔中加入50 μL 含100 TCID 的病毒液。
12.3.4 对照设立：每次试验每块培养板都应设立下列对照。
正常细胞对照：每块培养板上均设立2～4孔不接种病毒的正常细胞对照，每孔加入50μL。
阴性对照血清：设2～4孔，每孔加50μL 血清及50μL 含100 TCID 的病毒液。
阳性对照血清：阳性对照血清与被检血清平行稀释(如：2排孔),每孔加入50μL
含100 TCID₅ 的
病毒液。
病毒对照：另设一块培养板测定本次试验中病毒的实际滴度(TCIDs),
用以计算病毒的实际使
用量。
12.3.5 中和反应：封闭培养板，37℃培养1 h。
12.3.6 加入细胞：血清与病毒中和1 h 后，每孔加入50μL 细胞悬液，置37℃5%
CO₂ 温箱培养。对 照孔体积不足150μL 时，用稀释液补全体积。
12.3.7 染色：48 h
后，显微镜下预先作适当判读。第3天，将板固定并作常规染色。
正常细胞对照：在整个试验中应一直保持良好的生长形态，染色呈蓝色。
阴性对照血清：阴性对照血清孔应全部出现 CPE, 染色不着色。
阳性对照血清：阳性对照血清抗体滴度应在预期2倍以内。
病毒对照：根据试验中病毒的实际滴度(TCIDs),
计算病毒的实际使用量。每孔使用的病毒量应
在32 TCID～320 TCIDs范围内。
当以上对照均成立时，试验有效。
12.5.1
细胞层染色呈蓝色为阳性孔(病毒被中和),不着色为阴性孔(病毒未被中和),以血清能够中和
50%病毒时的稀释度为血清最终滴度。
12.5.2 被检血清最终滴度为1:45或更高者为阳性。
12.5.3 被检血清最终滴度低于1:16为阴性。
12.5.4
被检血清最终滴度在1:16～1:32之间为可疑，需要重复试验，再次试验结果为1:16或更高
时判定为阳性。
GB/T 18935—2018
13 液相阻断酶联免疫吸附试验(LPB-ELISA)
同7.1。
同7.2。
13.3.1 阳性对照血清：用与制备兔抗FMDV 抗血清抗原同源的FMDV
灭活疫苗免疫正常牛制备的高
免血清，预先测定其抗体效价。同待检血清一起作同样稀释。
13.3.2 阴性对照血清：阴性对照血清来自健康牛，各型口蹄疫 LB-ELISA
抗体效价均小于1:4。
13.4.1 ELISA 板每孔用50μLpH9.6
碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的兔抗血清包被，封板膜封板，置
室温过夜。
13.4.2 洗涤：每孔中加满洗涤缓冲液，放置30 s
后弃去，重复洗涤6次后在吸水纸巾上拍干酶标板。
13.4.3 在"U" 型96孔稀释板内，按50μL/
孔的量用样品稀释液将待检血清从1:4开始做2倍连续稀
释，每份待检血清都做2个重复，然后向每孔内加入相应的50μL
同型病毒抗原，封板混合后置4℃过 夜或37℃孵育1 h。
加入病毒抗原后血清的实际稀释度变为从1:8开始的2倍连续稀释度。
13.4.4 用洗涤缓冲液洗 ELISA
板6次，将各孔血清/抗原混合物从稀释板转移至兔抗血清包被的 ELISA
板中，每孔50μL,封板，37℃孵育1 h。
13.4.5 洗 ELISA
板6次，将与试验抗原同源的豚鼠抗血清用样品稀释液稀释至预定的最佳工作浓度，
每孔50μL,封板，37℃孵育1 h。
13.4.6 洗 ELISA 板6次，每孔加50μL 用酶标抗体稀释液稀释的兔抗豚鼠IgG
辣根过氧化物酶结合 物，封板，37℃孵育1 h。
13.4.7 洗 ELISA 板6次，每孔加50 μL TMB 底物溶液。37℃温育15 min
后每孔再加50 μL
1.25 mol/L 硫酸终止反应，混匀后在酶标仪450 nm 下判读结果。
13.4.8
对照设立：每次试验，每块板设8孔连续2倍稀释的阳性血清对照，2孔连续2倍稀释的阴性血
清对照，设4孔抗原对照，抗原对照不加血清稀释液。
病毒抗原对照至少两孔 OD₄m
值应在1.0～2.0范围内；阳性血清对照抗体滴度应在1:512~
1:2048之间；阴性血清对照抗体滴度应小于1:4。
13.6.1 以病毒抗原对照OD₅onm平均值的1/2为临界值，被检血清稀释孔 OD5mm
值大于临界值为阴
性孔，小于或等于临界值为阳性孔。抗体滴度以50%终点滴度表示，即该稀释度50%孔的抑制率大于
抗原对照孔抑制率的50%。
13.6.2
被检血清抗体滴度大于或等于1:128判为阳性。被检血清抗体滴度小于1:64判为阴性。被
检血清抗体大于或等于1:64并小于1:128判为可疑，可疑样品经再次测定后，如果有一个滴度为
1:64 或更高可判为阳性。
GB/T 18935—2018
14 固相竞争酶联免疫吸附试验(SPC-ELISA)
同7.1。
14.2.1 检测抗体：口蹄疫型特异性 HRP
标记的单克隆抗体，用样品稀释液稀释至最佳工作浓度。
14.2.2 其余试剂同7.2。
14.2.3 对照血清：同13.3。
14.3.1 酶标板每孔用50μLpH9.6
碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的兔抗血清包被，封板膜封板，置
14.3.2 用洗涤缓冲液洗板5次。
14.3.3 酶标板每孔用50μLpH9.6 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的FMDV
灭活抗原，封板膜封板，置
14.3.4 用洗涤缓冲液洗板5次。
14.3.5 在"U" 型96孔稀释板内，按50μL/
孔量用样品稀释液将待检血清从1:4开始做2倍连续稀
释，每份待检血清都做2个重复，然后整体平移至已包被抗体抗原复合物的 ELISA
反应板中。向每孔 内加入相应的50 μL
同型酶标单抗工作液，封板混合后，置37℃孵育30 min。 加入酶标抗体工作液后
血清的实际稀释度变为从1:8开始的2倍连续稀释度。
14.3.6 洗板5次，每孔加50 μLTMB 底物溶液。37℃温育15 min
后，每孔再加50μL2 mol/L 硫酸
终止反应，混匀后在酶标仪450 nm 波长下判读结果。
14.3.7
对照设立：每次试验，每块板设8孔连续2倍稀释的阳性血清对照、2孔连续2倍稀释的阴性血
清对照，以及不加血清稀释液的4孔酶标单抗对照。
在酶标仪 OD5nm
波长处，测定酶标板的每孔光吸收值，求出每份被检血清和同板酶标抗体对照的
平均光吸收值。酶标抗体对照孔的ODm
值应大于1.0;阳性血清抗体滴度应在1:512～1:2048 范
围内；阴性血清对照滴度应小于1:8。
14.5.1 以酶标抗体对照孔平均 OD₅0m 值的60%为临界值，被检血清 OD₅m
值大于临界值的孔为阴
性孔，小于或等于临界值的孔为阳性孔。以阳性孔的最高稀释倍数为被检血清的抗体滴度。
14.5.2
被检血清抗体滴度大于或等于1:64判为阳性。被检血清抗体滴度小于或等于1:32判为阴
性。被检血清抗体滴度介于1:32和1:64为可疑，需再次测定；若再次测定抗体滴度大于或等于1:
64判为阳性，小于1:64判为阴性。
15 非结构蛋白3ABC 抗体间接酶联免疫吸附试验(3ABC-
I-ELISA)
同7.1。
GB/T 18935—2018
15.2.1 阴性对照血清：无 FMDV 非结构蛋白抗体的健康牛、羊、猪血清。
15.2.2 阳性对照血清：FMDV 非结构蛋白3ABC 抗体阳性的牛、羊、猪血清。
15.2.3 洗涤缓冲液：配方见 B.6。
15.2.4 25 倍浓缩 PBS 缓冲液：配方见 B.7。
15.2.5 兔抗牛、羊或猪 IgG-HRP
酶结合物，使用时用血清稀释液稀释至工作浓度。
15.2.6 血清稀释液：配方见 B.8。
15.2.7 TMB 底物溶液：配方见 B.4.2。
15.2.8 终止液：0.3 mol/L 硫酸，配方见B.5.3。
15.2.9 纯化的3ABC 蛋白：将基因工程表达、纯化复性的3ABC 蛋白，用pH 9.6
的碳酸盐缓冲液包被 至酶标板，抽真空密封包装，4℃保存备用。
15.3.1 血清稀释板每孔加入血清稀释液120μL,
然后依次加入阳性对照血清、阴性对照血清和待检血 清，每孔6μL(1:21
倍稀释);标准阴、阳性对照血清平行加两孔，待测血清加1孔，留两孔不加血清作
为空白对照，轻振混匀；然后，将稀释好的血清按对应的位置转移至包被3ABC
抗原的 ELISA 板上，每 孔100μL, 用封口膜封口，37℃结合30 min。
15.3.2 去掉封口膜，每孔加满洗涤缓冲液，洗涤5次，最后一次拍干。
15.3.3 准备工作浓度的酶结合物，每孔加入100μL,
用封口膜封口，37℃结合30 min。
15.3.4 去掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。
15.3.5 每孔加入100 μLTMB 底物，封口膜封口，37℃避光作用10 min～15
min。显色过程中监测
OD₃0mm 值接近0.7时终止反应。
15.3.6 每孔加入100μL 终止液(终止后测定阳性对照孔 OD5m
值应小于2.1)。
15.3.7 轻轻摇振混匀，测定波长450 nm 吸光值。
阳性对照平均 OD50m 值应大于0.6;阴性对照平均 OD₅m 值应小于0.2。
15.5.1 样品效价=(OD50nm 样品 —OD₄50nm阴性对照)÷(OD50mm
阳性对照一OD₄50m 阴性对照)。
15.5.2
被检血清样品效价小于0.2,判为阴性。被检血清样品效价大于或等于0.3,判为阳性。被检血
清样品效价介于0.2～0.3之间为可疑；可疑样品复测效价大于或等于0.2,则判定为阳性。
16 非结构蛋白3ABC 抗体阻断酶联免疫吸附试验(3ABC-B-ELISA)
同7.1。
16.2.1 阴性对照血清，来自无 FMDV 抗体的健康动物。
16.2.2 阳性对照血清，来自 FMDV
感染康复动物，血清经灭活检验后无传染性因子存在。
16.2.3 弱阳性对照血清，来自 FMDV
感染康复动物，血清经灭活检验后无传染性因子存在。
16.2.4 25倍浓缩 PBS 缓冲液：配方见附录 B 的 B.7。
GB/T 18935—2018
16.2.5 3ABC 蛋白捕获抗体，利用3A 蛋白免疫小鼠制备的可特异性捕获3ABC
蛋白的单克隆抗体。
16.2.6 酶标检测抗体贮存液，利用3B
蛋白免疫小鼠制备的针对保守的免疫优势抗原表位的单克隆抗
体，经辣根过氧化物酶标记后，用作检测抗体，通常用酶标抗体保存液配制为100倍工作浓度。
16.2.7 血清稀释液：配方见B.8。
16.2.8 ELISA 用 TMB 底物溶液：配方见B.4.2。
16.2.9 终止液，0.3 mol/L 硫酸，见B.5.3。
16.2.10 捕 获 3ABC 抗原反应板：饱和浓度的3A
单克隆抗体包被酶标板，与基因工程表达、纯化复性 的 3ABC
蛋白结合，干燥酶标板后，抽真空密封包装，4℃保存备用。
16.3.1 取出密封的捕获3ABC
抗原反应板，所有的试剂在使用前应先恢复至15℃~25℃,通过涡旋
振荡器轻振血清样品混匀。
16.3.2 加血清：每孔加入80 μL 血清稀释液，然后依次加入20 μL
待测血清和阳、弱阳性与阴性对照血
清。待测样品加1孔，阴性、弱阳性与阳性对照血清平行加2孔，振荡混匀，封口膜封口，在15℃~
25℃条加下振荡孵育。检测牛、羊血清时，孵育1 h; 检测猪血清时，孵育16 h～20
h。 小心去掉封口 膜，每孔加约300μL 洗涤液洗板5次，最后一次拍干。
16.3.3
加酶标单抗：用血清稀释液1:100比例稀释100倍浓缩酶标单抗，每孔加入100μL,
封口膜封 口，置15℃~25℃孵育1 h。 小心去掉封口膜，每孔加约300μL
洗涤液洗板5次，最后一次拍干。
16.3.4 加底物：每孔加入100 μLTMB
底物溶液，封口膜封口，置15℃~25℃避光孵育10 min～15 min。
16.3.5 终止反应测吸光值：每孔加入100 μL 终止液，在450 nm
测量和记录各样品和对照品的吸光 值。加终止液之前，可以测定OD30nm 值，将
OD30m 值控制在0.5～0.6之间，保证最佳的检测效果，终 止前 OD₆ 30m
值约为终止后 OD₆ 30nm 值的1/3。
16.4.1 计算阴性、弱阳性与阳性对照血清平均 OD₅m
值。根据公式计算测试样本(弱阳性、阳性对照
血清与待测血清)阻断率(PI),PI=(1 一测试样本 OD₅0m 值/阴性对照平均 OD₅0m
值)×100%。
16.4.2 结果有效性判定：阴性对照平均 OD5m
值应大于1.0;弱阳性对照血清阻断率应大于50%,阳
性对照血清阻断率应大于70%,试验有效。
试验结果有效，被检血清样品 PI 值大于或等于50%,判定为 FMDV NSP
3ABC抗体阳性；被检血
清样品 PI 值小于50%,判定为 FMDV NSP 3ABC抗体阴性。
17.1
临床判定为疑似的易感动物，经第6章(病毒分离)分离出口蹄疫病毒，或经第7章(定型
ELISA) 检测出口蹄疫病毒抗原，或经第8章(多重 RT-PCR)、 第9章(定型
RT-PCR)、 第10章(病毒 VP1 基 因 序列分析)、第11章(荧光定量 RT-PCR)
任一项检测出口蹄疫病毒核酸的，可判定为口蹄疫发病。
17.2 临床无明显特异症状的非免疫动物经第12章(VN)、 第 1 3 章(LPB-ELISA)、
第 1 4 章 (SPC- ELISA)、 第15章(3ABC-I-ELISA)、 第16章(3ABC-B-ELISA)
任一项检测出口蹄疫病毒抗体的，或从
免疫动物中检测出非免疫所致的口蹄疫病毒抗体的，可判定该动物曾经感染过口蹄疫病毒。
17.3 临床无明显特异症状的易感动物，采集 O-P
液或组织样品经第6章(病毒分离)、第7章(定型 ELISA)、 第8章(多重 RT-PCR)、
第9章(定型 RT-PCR)、 第10章(病毒 VP1 基因序列分析)、第11章 (荧光定量
RT-PCR) 任一项检测出阳性的，可判定为口蹄疫带毒(潜伏感染或持续感染)。
GB/T 18935—2018
(规范性附录)
样品保存液和细胞培养液
A.1 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)
氯化钠(NaCl)
磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)
磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)
加蒸馏水至
或者
氯化钠(NaCl)
氯化钾 (KCl)
磷酸氢二钠(Na₂HPO₄ · 12H₂O)
磷酸二氢钾(KH₂PO₄)
加蒸馏水至
A.2 0.04 mol/L PBS(pH 7.4)
蒸馏水
85.00
15.49
2.03
1000
80.0 2.0 30.0
|
|
|---|
103 kPa 高压蒸汽灭菌30 min,室温或4℃冰箱保存。
A.3 50% 甘油-PBS 保存液
0.04 mol/LPBS与纯甘油等量混和，调整pH 至7.4,分装成小瓶。103 kPa
高压蒸汽灭菌30 min。
室温或4℃冰箱保存。
A.4 O-P 液保存液
Eagle's-MEM 营养液 50 mL
0.5%水解乳白蛋白/Earle's液 50 mL
5%碳酸氢钠(NaHCO₃) 调整 pH 至7.6～7.8。
A.5 细胞培养液与细胞维持液
A.5.1 Eagle's-MEM
10×Eagle's-MEM 营养液：Eagle's-MEM 营养剂9.5g,加超纯水100.0 mL。
溶解后过滤除菌。 用无菌超纯水将10×营养液按1:10稀释，即100 mL
营养液中加入900 mL 无菌超纯水中即为使用
浓度营养液，4℃保存备用。
A.5.2 0.5% 水解乳白蛋白/Earle's 液
| 氯化钠(NaCl) | 6.8 g |
|---|---|
| 氯化钾 (KCl) | 0.4 g |
| 氯化钙 (CaCl₂) | 0.2 g |
| 硫酸镁 (MgSO₄ ·7H₂O) | 0.2 g |
| 磷酸二氢钠(NaH₂PO₄ ·H₂O) | 0.14 g |
| 葡萄糖 | 1.0 g |
| 10%酚红 | 2.0 mL |
| 水解乳白蛋白 | 5.0 g |
按配方称取各成分并逐个溶解，最后加超纯水至1000 mL,
过滤除菌。4℃保存备用。
A.5.3 细胞维持液
GB/T 18935—2018
Eagle's-MEM 营养液 50 mL
0.5%水解乳白蛋白/Earle's液 50 ml
5%碳酸氢钠(NaHCO₃) 调整 pH 至7.6～7.8。
A.5.4 细胞营养液
Eagle's-MEM 营养液 45 mL
0.5%水解乳白蛋白/Earle's液 45 mL
犊牛血清 10 mL
5%碳酸氢钠 (NaHCO₃) 调整 pH 至7.2～7.4。
GB/T 18935—2018
(规范性附录)
酶联免疫吸附试验用溶液的配制
B.1 包被缓冲液：碳酸盐缓冲液(0.05 mol/LNa₂CO₃-NaHCO₃,pH 9.6)
A 液 ： Na₂CO₃ 1.68 g
蒸馏水 400 mL
B 液： NaHCO₃ 2.86 g
蒸馏水 200 mL
将400 mLA 液与150 mLB 液混合，调整 pH 至9.6,4℃放置1个月有效。
B.2 样品稀释液[含0.05%(体积分数)吐温-20的0.01 mol/LPBS,pH
7.2～7.4]
Na2HPO₄ · 12H₂O 0.30 g
KH₂PO 0.02 g
NaCl 0.80 g
KCl 0.02 g
吐温-20 0.05 mL
加蒸馏水至100 mL。
B.3 定型 ELISA、液相阻断 ELISA、固相竞争 ELISA 洗涤缓冲液(0.002
mol/L PBS,pH7.4±0.2)
Na₂HPO₄ ·H₂O 0.60 g
KH₂PO 0.04 g
NaCl 1.60 g
KCl 0.04 g
加蒸馏水至1000 mL。
B.4 底物溶液
B.4.1 OPD 底物溶液
| Na₂HPO₄ · 12H₂O | 1.84 |
|
|
|---|---|---|---|
柠檬酸(C₆H₈O₇ , 邻苯二胺(OPD) |
|
0.52 0.05 |
|
| 加去离子水100 |
|
分装成3 mL/ 瓶， -20℃避光保存。使用前避光融化，每3 mL 上述溶液加15μL3%
双氧水
(H₂O₂)。
B.4.2 TMD 底物溶液
A 液： TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)
无水乙醇
蒸馏水加至1000 mL。
B 液 ： 磷酸氢二钠(Na₂HPO, 分析纯)
柠檬酸(C₆H₈O₇ , 分析纯)
0.75%过氧化氢尿素
加蒸馏水至1000 mL, 调整 pH 至5.0～5.4。
将底物溶液 A 和底物溶液 B 按1:1混合，现配现用。
B.5 终止液
B.5.1 1.25 mol/L 硫酸
取68 mL 分析纯浓硫酸缓慢加入到932 mL 去离子水中，分装室温保存。
GB/T 18935—2018
B.5.2 2 mol/L 硫 酸
116 mL分析纯浓硫酸缓慢加入884 mL 去离子水中，分装室温保存。
B.5.3 0.3 mol/L 硫酸
16.6mL 分析纯浓硫酸缓慢加入983.4 mL 去离子水中，分装室温保存。
B.6 NSP 3ABC 抗体间接/阻断 ELISA 用洗涤缓冲液
NaCl 8.0 g
KCl 0.2 g
KH₂PO₄ 0.2 g
Na₂HPO₄ · 12H₂O 2.9 g
吐温-20 0.5 mL
加蒸馏水至1000 mL, 调整 pH7.4。
B.7 25 倍浓缩磷酸盐缓冲液(25×PBS)
NaCl 200.0 g
KCl 5.0 g
Na₂HPO₄ · 12H₂O 72.5 g
KH₂PO 5.0 g
加蒸馏水至1000 mL。103 kPa 高压蒸汽灭菌30 min,室温保存备用。
B.8 NSP 3ABC 抗体间接/阻断 ELISA 用血清稀释液
马血清 100 mL
酪蛋白 2.5 g
硫柳汞 0.1 g
25倍浓缩磷酸盐缓冲液 40.0 mL
补充无菌双蒸水或超纯水至1000 mL。
style="width:3.08672in" />GB/T 18935—2018
(规范性附录)
核酸检测用液体配制
C.1 50×TAE 贮存液
三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242.0 g
冰乙酸 57.1 mL
0.5 mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0) 100.0 mL
加双蒸水至1000 mL。
C.2 1×TAE 缓冲液
使用前将50×TAE 作50倍稀释即可。
C.3 电泳加样缓冲液
溴酚蓝 0.25 g
甘油 30.0 mL
双蒸水 70.0 mL
更多内容 可以 GB-T 18935-2018 口蹄疫诊断技术. 进一步学习